L'efficacité des nanoparticules d'argent biosynthétisées contre les isolats de Pseudomonas aeruginosa de patients atteints de mucoviscidose

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8876 (2023) Citer cet article

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La haute résistance aux antibiotiques de Pseudomonas aeruginosa (PA) rend essentiel le développement d'agents antimicrobiens alternatifs efficaces et abordables. L'une des nombreuses applications des nanoparticules d'argent (Ag NPs) est leur utilisation comme agent antimicrobien contre les bactéries résistantes aux antibiotiques courants. L'objectif principal de cette recherche était d'évaluer l'efficacité antibactérienne et antibiofilm des NP Ag biosynthétisées contre six souches de PA cliniquement isolées formant un biofilm et une souche de référence (ATCC 27853). Les NP Ag ont été biosynthétisées en utilisant un extrait de graines de Peganum harmala comme agent réducteur. Les NP Ag ont été caractérisées par spectroscopie ultraviolette visible (UV–Vis) et microscopie électronique à transmission à balayage (STEM). L'effet des NP Ag sur la formation et l'éradication du biofilm a été examiné par des essais sur plaque de microtitration, et les concentrations minimales inhibitrices (MIC) et minimales bactéricides (MBC) ont été déterminées. De plus, des réactions en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) ont été réalisées pour examiner les effets des NP Ag sur l'expression de sept gènes codant pour le biofilm PA (LasR, LasI, LssB, rhIR, rhII, pqsA et pqsR). Les Ag NPs biosynthétisés étaient de forme sphérique avec un diamètre moyen de 11 nm. La CMI pour chaque souche PA était de 15,6 µg/ml, tandis que la MBC était de 31,25 µg/ml. Toutes les souches de PA exposées aux NP d'Ag à des concentrations sous-inhibitrices (0,22 à 7,5 µg/ml) ont montré des effets inhibiteurs significatifs sur la croissance et la formation de biofilm. Le métabolisme de la biomasse et du biofilm a été réduit en fonction de la concentration d'Ag NP. L'expression des gènes de détection de quorum de toutes les souches était significativement réduite à une concentration d'Ag NP de 7,5 µg/ml. Les résultats démontrent les vastes performances antibactériennes et antibiofilms in vitro des NP Ag et leur potentiel dans le traitement de l'infection par l'AP. Il est recommandé que les études futures examinent la synergie possible entre les NP Ag et les antibiotiques.

Pseudomonas aeruginosa (PA) est un agent pathogène nosocomial courant qui peut entraîner la mort chez les personnes immunosupprimées, malignes, brûlées, blessées ou atteintes de fibrose kystique1. Le PA peut former un biofilm sur diverses surfaces abiotiques, y compris les implants artificiels, les cathéters urinaires, les tubes endotrachéaux et les lentilles de contact2. Les substances polymères extracellulaires (EPS) forment les structures matricielles des biofilms qui entourent les communautés bactériennes3. Les biofilms sont une préoccupation importante car ils peuvent résister au système immunitaire de l'hôte et à de nombreux antimicrobiens3. Les peptides antimicrobiens sont électrostatiquement repoussés ou décomposés par la matrice du biofilm, protégeant les cellules à l'intérieur de la phagocytose et de la réponse immunitaire de l'hôte4,5. Un système de communication de cellule à cellule appelé détection de quorum (QS) régule plusieurs processus dans l'AP, y compris la production de biofilm6.

Les cellules cibles de nombreux antimicrobiens sont profondément ancrées dans la matrice du biofilm, ce qui rend leur traitement extrêmement difficile7. La résistance aux antibiotiques est désormais un problème de santé mondial majeur8, et le besoin de traitements non antibiotiques pour les maladies microbiennes résistantes aux médicaments a considérablement augmenté. Les nanoparticules offrent une approche alternative, facile à synthétiser, pour le traitement des infections à PA car leur petite taille et leur rapport surface/volume élevé les rendent efficaces contre les biofilms9.

Parmi les nombreuses nanoparticules couramment produites, les NP Ag se distinguent par leur capacité exceptionnelle à combattre les isolats bactériens pathogènes multirésistants10. Il est largement reconnu que les NP Ag ont une activité antibactérienne et antibiofilm sur les bactéries pathogènes non résistantes et résistantes10,11,12. Les NP Ag exercent leur activité antibiofilm en reconnaissant la structure peptidoglycane des membranes bactériennes et en se liant à la matrice exopolysaccharidique. La structure du biofilm est alors gravement endommagée ou détruite par le stress oxydatif et les dommages à l'ADN produits par la production de ROS et la libération d'ions13,14,15. Les NP Ag ont également un potentiel important d'utilisation à des fins médicales et non médicales en raison de leur large gamme de tailles, de leur capacité d'auto-assemblage et de leur activité antibactérienne élevée16.

La nanotechnologie à médiation biogénique intègre les principes de la chimie verte dans la production de nanoparticules. Les extraits végétaux ont été largement étudiés dans la fabrication de nanoparticules métalliques et peuvent augmenter leur monodispersité. Les biomolécules présentes dans les plantes (par exemple, les flavones, les composés phénoliques, les protéines, les polysaccharides, les terpénoïdes, les alcaloïdes, les enzymes, les acides aminés et les alcools) sont des agents réducteurs efficaces et servent d'agents de coiffage qui stabilisent et contrôlent la structure des NP17,18,19,20. Les techniques biogéniques fournissent un processus propre et écologique pour synthétiser les nanoparticules utilisées dans de nombreuses applications cosmétiques et pharmaceutiques. Ainsi, il existe un intérêt généralisé pour l'application de techniques biogéniques pour la production verte de nanoparticules21,22.

La plante glabre et vivace Peganum harmala, communément appelée Harmal, pousse dans les sols sableux des zones semi-arides. L'arbuste mesure entre 0,3 et 0,8 m de long et contient des capsules de graines sphériques avec plus de 50 graines et des fleurs blanches. Au Moyen-Orient, cette plante est largement cultivée à des fins médicinales et se trouve dans les régions marginales et désertiques de Jordanie23 où elle est traditionnellement utilisée comme antiseptique et désinfectant en brûlant ou en faisant bouillir ses graines24. La plante a été utilisée pour le traitement de diverses affections humaines, notamment le lumbago, l'asthme, les coliques, la jaunisse et comme emménagogue stimulant25,26. Il a également été prétendu avoir des propriétés antibactériennes, antivirales et antifongiques26,27.

Dans la présente étude, P harmala a été utilisé comme agent réducteur dans la biosynthèse des Ag NPs. Les propriétés antibactériennes et antibiofilm des Ag NPs ont été examinées sur des isolats cliniques de six souches de PA. L'effet de l'exposition à différentes concentrations d'Ag NPs pendant la formation du biofilm a également été évalué. De plus, l'influence des Ag NPs sur l'expression des gènes impliqués dans la régulation QS et la synthèse des polysaccharides du biofilm PA a été étudiée.

La souche standard PA 27853 de l'American Type Culture Collection (ATCC), ainsi que six isolats cliniques (PA1, PA2, PA3, PA4, PA5 et PA6) ont été utilisés dans cette étude. Le PA ATCC a été obtenu à partir du panel international de PA et la totalité de sa séquence génomique est disponible28. Les souches cliniques ont été isolées à partir d'échantillons de crachats de patients atteints de mucoviscidose au laboratoire de microbiologie de l'hôpital jordanien Prince Hamza. La coloration de Gram, la synthèse de pigments verts sur gélose nutritive, la croissance sur gélose MacConkey, le test d'oxydase, la motilité, la croissance sur milieu sélectif gélose cétrimide et la capacité de croissance à 42 °C ont été utilisées pour identifier la bactérie PA. Le système informatique d'identification automatique des bactéries VITEK2 (Bio Merière, Lyon, France) a été utilisé pour la vérification.

La technique du bouillon Brain-Heart Infusion (BHI) a été utilisée pour enrichir les échantillons (OxoidTM). Après enrichissement, les échantillons ont été cultivés en utilisant les approches de plaque de strie et de plaque de coulée sur Pseudomonas Cetrimide Agar (PSA) (OxoidTM). Pour chaque souche, les chercheurs ont initié des sous-cultures à partir de colonies individuelles, qui ont toutes été cultivées en aérobiose sur des plaques PSA à 37 °C. Après 18 à 24 h d'incubation, des cultures fraîches ont été préparées à des concentrations de 0,5 sur l'échelle de McFarland (1,5 × 108 UFC/mL). Plusieurs dilutions différentes ont été testées au cours du processus d'évaluation.

Des plantes entières de P. harmala ont été récoltées dans la région d'Al-Hallabat du gouvernorat de Zarqa en juillet 2022 dans une ferme du ministère de l'Agriculture. L'identification des graines de P. harmala a été vérifiée par comparaison avec l'échantillon vérifié conservé dans l'herbier de la Faculté d'agriculture de l'Université jordanienne des sciences et technologies (JUST) et confirmée par le professeur adjoint d'agriculture (Dr Muayyad Bani-Hani). Le spécimen de bon (AM/2023/01/001) a été déposé à l'herbier situé au Département de la production et de la protection des plantes de l'Université de Jerash, en Jordanie. P. harmala a été récolté conformément à toutes les directives et législations institutionnelles, nationales et internationales.

Les graines ont été lavées avec de l'eau bidistillée (Sigma-Aldrich HPLC Plus Water), soigneusement séchées à température ambiante et broyées mécaniquement en une poudre grossière. Cinq grammes de cette poudre ont été combinés avec 50 ml d'eau bidistillée et chauffés à 70 °C pendant 15 minutes avant d'être filtrés deux fois sur du papier filtre Whatman. Une microfiltration à travers un filtre à membrane de seringue de 0,22 mm a été utilisée pour produire un extrait aqueux clair avec un pH de 5,4 à 25 °C.

Une solution de 50 ml d'AgNo3 3 mM a été réchauffée à 80 °C dans un flacon Erlenmeyer de 100 ml recouvert d'une feuille d'aluminium et mélangée à l'aide d'un agitateur magnétique à une vitesse continue de 1100 tr/min. Un extrait aqueux de graines de P. harmala a été ajouté goutte à goutte à un débit de 34 µl/min à l'aide d'une micropipette jusqu'à ce que 4 ml aient été ajoutés. Un changement de la couleur de la solution de l'orange au brun foncé a été la première indication de la synthèse d'Ag NP. La solution a ensuite été centrifugée à 6000 tr/min pendant 30 min trois fois pour éliminer le P harmala n'ayant pas réagi.

La spectroscopie UV-visible (UV-1900, SHIMADZU, Japon) a été utilisée pour suivre visuellement la bioréduction de l'AgNO3 et la production de NP Ag biogéniques à partir de l'extrait aqueux de P. harmala. De l'eau bidistillée a été utilisée comme référence de contrôle. Chaque analyse spectrophotométrique a été effectuée dans une cuvette en quartz avec une longueur de trajet de 1,00 cm. La résonance plasmonique de surface (SPR) des Ag NP a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible, en utilisant des longueurs d'onde de 800 à 300 nm comme marqueur de la formation d'Ag NP.

Le microscope électronique à transmission à balayage (STEM) (Versa 3D, FEI, Pays-Bas) produit des images dérivées d'électrons traversant un spécimen mince. Cela a été utilisé pour tester la morphologie et les caractéristiques de taille des nanoparticules d'argent synthétisées.

Un diffractomètre à rayons X a été utilisé afin de mesurer les spectres de diffraction des rayons X (DRX) des NP d'oxyde de zinc. Celui-ci était équipé d'une source de rayonnement comprenant CuKa, qui avait une longueur d'onde de 0,154 nm. Le conteneur de spécimen mesurait 2 cm × 0,5 mm.

L'analyse FT-IR des Ag NPs et de l'extrait de graines de P. harmala a été réalisée dans le département de chimie de l'Université Hashemite et a permis d'évaluer les relations entre les groupes fonctionnels de l'extrait de P. harmala et les Ag NPs synthétisés dans une plage de nombres d'onde de 3600 à 400 cm−1.

La diffusion sur disque a été utilisée pour évaluer la sensibilité des souches PA à 10 antibiotiques anti-pseudomonas selon la procédure du Clinical Laboratory and Standards Institute (CLSI). La suspension cellulaire dans une solution saline a été ajustée à 0, 5 McFarland et inoculée dans Muller Hinton Agar-MHA pour initier une croissance bactérienne exponentielle (18 à 24 h) (Sigma-Aldrich). La plaque a été recouverte de disques antibiotiques, qui ont ensuite été incubés pendant 18 à 24 h à 35 ± 2 °C. La sensibilité bactérienne à ces antibiotiques a été confirmée en mesurant le diamètre des zones d'inhibition créées et en les interprétant conformément aux valeurs fixées par le CLSI29.

Dix antibiotiques anti-pseudomonaux différents ont été utilisés : aztréonam 30 µg (ATM), ciprofloxacine 5 µg (CIP), pipéracilline 100 µg (PRL), amikacine 30 µg (AK), ceftazidime 30 µg (CAZ), céfépime 30 µg (FEP), gentamicine 10 µg (CN), lévofloxacine 5 µg (LEV), imipen em 10 µg (IPM) et méropénem 10 µg (CT). Tous les disques anti-pseudomonas ont été achetés chez Oxoid, Royaume-Uni.

La CMI d'un agent antimicrobien fait référence à la concentration minimale requise pour supprimer la croissance visible des microbes cibles après 12 h d'incubation. La concentration bactéricide minimale (MBC) fait référence à la concentration minimale nécessaire pour s'assurer qu'aucun microbe ne reste viable après une exposition à l'antimicrobien (c'est-à-dire qu'aucune croissance n'est observée dans une culture ultérieure dans un milieu non traité).

La CMI des NP Ag a été déterminée à l'aide du processus de dilution en bouillon de microtitration30. Les Ag NPs ont été utilisés contre la souche de référence ATCC PA 27853 et les six isolats cliniques en triple et dans trois expériences distinctes. Dans chaque test, 100 μl de bactéries à une densité de 5 × 105 UFC / ml dans du Muller Hinton Broth (MHB) (Oxoid) ont été ajoutés aux plaques de dosage à 96 puits (Corning, NY) contenant différentes concentrations d'Ag NP. Le PA ATCC 27853 a été utilisé comme contrôle positif tandis que le contrôle négatif a été ensemencé avec un bouillon incubé dans des conditions identiques mais sans ajout d'Ag NP.

Les concentrations d'Ag NP utilisées pour les tests variaient de 1 mg/ml à 3,9 μg/ml et ont été obtenues par dilution en série au double. Les microplaques inoculées ont subi une période d'incubation de 24h à 37°C et 150 rpm. Le contrôle a été incubé pendant 24 h à 37 ° C et contenait un bouillon inoculé sans Ag NPs. Le critère d'évaluation de la CMI fait référence à la concentration minimale d'Ag NP à laquelle aucune croissance discernable n'a pu être observée dans les puits. Une dilution de microtitration à base de tétrazolium a été utilisée pour confirmation.

Comme le NADH cellulaire entraîne la création de sels de formazan colorés, les sels de tétrazolium sont fréquemment utilisés comme réactifs dans les tests biologiques pour évaluer le comportement métabolique des cellules vivantes31. Les colorants à base de tétrazolium sont donc couramment utilisés pour identifier les CMI et évaluer les biofilms32. Dans cette étude, le chlorure de triphényltétrazolium (TTC) a été utilisé comme marqueur métabolique de la survie bactérienne et du développement du biofilm. Après l'incubation initiale de 24 h, 40 μl de 0,2 mg/ml de TCC dissous dans de l'eau désionisée ont été ajoutés aux puits et l'incubation s'est poursuivie pendant 4 à 6 h supplémentaires à 37 °C. Les changements de couleur ont ensuite été évalués et comparés à ceux des témoins.

La concentration la plus faible ne modifiant pas la couleur du colorant a été considérée comme la CMI contre les bactéries cibles. Pour atteindre la fiabilité, l'expérience a été répétée trois fois chacune avec des témoins positifs et négatifs.

Après avoir établi les CMI Ag NP, des aliquotes de 50 µl ont été ensemencés à partir de tous les puits ne montrant aucune croissance bactérienne évidente. Ils ont été placés sur des plaques de gélose BHI et incubés à 37°C pendant 24h. Par la suite, l'élimination de 99, 9% des bactéries par la plus faible concentration de NP Ag a été prise comme critère d'évaluation MBC (Fig. 1 supplémentaire).

Des plaques de microtitration transparentes stériles et non traitées avec des fonds plats à 96 puits (BD Falcon)33 ont été utilisées pour examiner la croissance bactérienne et le développement du biofilm sous les différentes concentrations d'Ag NP. Pour effectuer le test de croissance, des suspensions standard ont été créées de chaque culture PA. Des aliquotes de 105 µl de Tryptone Soy Broth (TSB) ont été appliquées à chaque puits, auxquelles 20 µl d'aliquotes de bactéries ont été ajoutées et combinées avec 125 µl des différentes concentrations d'Ag NPs (0,225–7,5 µg/ml). Cela a donné un volume total de 250 ul dans chaque puits du plateau de microtitration. Tous les dosages ont été effectués trois fois. Des témoins positifs et négatifs ont également été utilisés, le premier contenant du PA et du TSB (et pas de NP Ag) et le second ne contenant que du TSB.

Une fois la préparation terminée, les cultures ont subi une incubation aérobie pendant 24 h à 37 ° C, au cours de laquelle elles ont été stockées dans l'obscurité et ont été soumises à des secousses. Après l'incubation, le nombre de cellules à différentes concentrations de NP Ag a été déterminé en évaluant la densité optique (DO) à 600 nm (Infinite® 200 PRO NanoQuant, TECAN). La valeur finale de croissance cellulaire pour chaque concentration d'Ag NP a été calculée comme la différence entre les moyennes des lectures de puits avec et sans inoculation de PA. Toutes les cellules présentaient une expansion cellulaire associée au biofilm et planctonique.

Une approche spectrophotométrique a été utilisée pour quantifier la production de biofilm en mesurant sa biomasse totale, qui comprend les cellules bactériennes et les EPS34,35. Deux puits distincts ont été créés sur des plaques de microtitration séparées en parallèle pour chaque condition de test. L'un des puits a ensuite été coloré avec du Crystal Violet (CV) et l'autre avec le colorant métabolique TTC.

Après incubation de la plaque pendant 24 h sans agitation (un peu comme une expérience de croissance), chaque puits a été aspiré et lavé trois fois dans du sérum physiologique stérile (250 µl). Une fois le puits aspiré, les plaques ont été vigoureusement secouées pour éliminer toute bactérie non liée.

Les micro-organismes restants sur la première plaque ont été fixés dans 200 µl de méthanol à 99 %. Les plaques ont été laissées pendant 15 min, après quoi elles ont été vidées et laissées sécher. Chaque plaque a ensuite été colorée pendant 5 min avec 2 % Hucker CV, une solution sans coloration de Gram, appliquée à raison de 200 µl dans chaque puits. Pour éliminer tout matériau de coloration supplémentaire, les puits ont été nettoyés trois fois dans 200 ul d'eau stérile. On a pris soin de ne pas perturber le biofilm pendant l'étape de lavage. Les plaques ont ensuite été laissées à nouveau sécher avant que le colorant lié aux cellules ne soit resolubilisé en utilisant 160 ul d'acide acétique glacial à 33 % (v/v) par puits.

Un lecteur automatisé (l'ICN Flow Titertek Multiscan Plus) a été utilisé pour mesurer les mesures de DO dans les puits. Les lectures ont été prises à trois moments différents : premièrement, avant l'incubation des échantillons (OD 600 nm) ; deuxièmement, post-incubation pour évaluer la croissance (OD 600 nm); et troisièmement, après avoir terminé le test de biofilm (OD 570 nm). Un rapport de 570/600 a été utilisé pour normaliser la mesure de la formation de biofilm par rapport à la croissance bactérienne. Les valeurs de DO négatives étaient affichées comme zéro. Chaque expérience a été réalisée trois fois et une valeur seuil (ODc) déterminée à partir des écarts-types (SD). La DOc utilisée était la moyenne du contrôle négatif + 3 DS. Les isolats ont ensuite été répartis en quatre catégories de producteurs de biofilm comme suit : non producteur (OD < ODc) ; faible producteur (ODc < OD < 2 × ODc) ; producteur modéré (2 × ODc < OD < 4 × ODc) ; et fort producteur (4 × ODc < OD).

L'activité métabolique a été évaluée sur la deuxième plaque avec le TTC utilisé comme marqueur pour la croissance bactérienne viable. Le TTC est converti par des cellules métaboliquement actives en un dérivé de formazan facile à mesurer par colorimétrie. Semblables aux expériences de croissance, les plaques ont été vigoureusement secouées pour éliminer toutes les bactéries qui n'avaient pas adhéré après une incubation de 24 h à 37 °C.

Tous les puits avaient leur milieu retiré après incubation et 200 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ont été utilisés pour laver le biofilm. Les cellules du biofilm des puits avec biofilm ont été vigoureusement pipetées dans la suspension après avoir ajouté 100 μl de solution PBS. Le biofilm en suspension a ensuite été déplacé sur une nouvelle microplaque à fond plat de 96 puits.

Une concentration finale de 0,02% a été obtenue en ajoutant 50 µl de TTC 0,1% (Sigma, USA). Les échantillons ont été laissés à incuber à 37 ° C pendant 4 à 5 h, après quoi la DO405 a été mesurée avec un lecteur de microplaques VERSA max. L'absorbance colorimétrique à 405 nm est un moyen efficace pour quantifier l'inhibition de la croissance bactérienne car le formazan rouge est produit lorsque des bactéries viables réduisent le TTC36.

Pour évaluer l'impact des NP Ag sur la production d'EPS, une méthode modifiée de précipitation à l'éthanol37 a été utilisée. L'extraction d'EPS de chaque souche a été réalisée en triple exemplaire. Une suspension bactérienne 0,5 McFarland de chaque souche dans du bouillon LB a été préparée et ajoutée dans 100 ml de bouillon LB contenant des NP Ag à des concentrations allant de 7,5 à 0,225 μg / ml et a été incubée à 37 ° C pendant 24 h. Le contrôle a été préparé sans l'ajout d'Ag NPs. Après incubation, l'EPS a été extrait des cultures bactériennes par centrifugation à 10 000 tr/min pendant 30 min à 4 °C. Pour précipiter l'EPS, 1 volume d'éthanol à 95% a été ajouté à chacun des 3 volumes de surnageant collecté de la centrifugeuse et placé sous réfrigération à 4 ° C pendant 18 h. Le mélange a ensuite été à nouveau centrifugé à 10 000 tr/min pendant 20 min en maintenant la température à 4 °C. L'EPS précipité a été recueilli et remis en suspension à l'aide d'eau bidistillée. Toute trace de cellules bactériennes a été éliminée de la suspension par filtration à l'aide d'une membrane d'acétate de cellulose de 0,45 μm. Pour confirmer l'absence de toute bactérie viable, un échantillon a été placé sur une plaque de gélose dans des conditions de culture optimales pour vérifier la croissance. L'EPS extrait a ensuite été lyophilisé et pesé pour donner un résultat en mg d'EPS pour 100 ml.

Une technique combinant la coloration CV34,35 avec un colorant tétrazolium sensible au métabolisme a été utilisée pour évaluer l'impact des NP Ag sur les biofilms préformés. Des suspensions bactériennes standardisées ont été créées par culture d'une nuit dans deux plaques de 96 puits avec du TSB à une concentration de 0,5 McFarland. Des biofilms ont été produits en ajoutant des aliquotes de 20 µl de suspension bactérienne à des aliquotes de 250 µl de TSB (sans Ag NPs). Les plaques ont ensuite été laissées à incuber pendant une nuit à 37 ° C pour permettre au biofilm de se développer et de se fixer aux plaques.

Deux puits séparés ont été créés pour chaque condition sur des plaques de microtitration individuelles, l'un pour la coloration avec CV et l'autre pour la coloration avec TTC métabolique. Le milieu a été retiré de la plaque le lendemain et laissé sécher pendant 15 min sur une serviette en papier à température ambiante. Après le retrait des cellules planctoniques et non attachées, une pipette multicanaux a été utilisée pour rincer le biofilm adhérent. Ce processus a été effectué trois fois en utilisant 150 ul de milieu stérile. Chaque puits avait son excès de milieu de lavage aspiré avant d'ajouter 200 µl de MHB frais contenant les différentes concentrations d'Ag NPs. Les plaques ont été incubées à 37°C pendant 24h. La croissance planctonique a été examinée le lendemain, après quoi les cellules planctoniques et les milieux utilisés ont été retirés, et la biomasse résiduelle a été lavée trois fois dans de l'eau distillée. Une plaque a ensuite été colorée avec du CV et l'autre avec du TCC. Les valeurs moyennes de DO490 ont ensuite été obtenues à partir des résultats des trois réplicats biologiques indépendants36.

Un test qRT-PCR a été réalisé pour estimer l'impact des concentrations élevées (7,5 µg/ml) et faibles (0,45 µg/ml) d'Ag NPs sur l'expression des gènes régulateurs QS. Le PA a été incubé dans du milieu MH avec les NP Ag à 37 ° C et à 50–60 tr/min dans des plaques à 6 puits (Corning, NY). Les contrôles ont été incubés dans des conditions identiques mais sans Ag NPs. Après une exposition de 24 à 48 h (phase exponentielle de croissance du biofilm), le biofilm a été soigneusement récolté et rincé doucement avec du NaCl 10 mM pour éliminer les cellules non attachées. L'ARN du biofilm a été extrait à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen, Allemagne).

Pour synthétiser l'ADNc, des amorces aléatoires (y compris RNaseOUT, dNTP et la transcriptase inverse Superscript II (Tsingke, Pékin, Chine) ont subi une réaction PCR de transcription inverse à 42 °C. Universal qPCR Master Mix et 7 μl d'eau sans nucléase pour donner un volume de réaction final de 20 μl.

Une réaction de PCR en gradient a été réalisée pour toutes les amorces de PCR utilisées dans cette étude. Les conditions de cyclage ont été soumises à une pré-dénaturation à 95 ° C pendant 3 min, après quoi 34 cycles de dénaturation ont été effectués à 94 ° C, chacun pendant trente secondes, et un recuit à une température comprise entre 50 et 63 ° C pendant trente secondes. Cela a été suivi d'une élongation à 72 ° C pendant 60 s. Enfin, la réaction a été prolongée pendant 5 minutes à une température de 72°C. Les valeurs d'expression relatives des gènes régulateurs QS ont été normalisées par rapport aux gènes domestiques rpoD et rpsL, et l'amplification PCR spécifique a été vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose. Pour le PA traité, le niveau d'expression génique a été calculé par rapport à celui du PA non traité. Pour ce faire, la technique 2−ΔΔCt a été employée38. Les séquences d'amorces utilisées dans cette recherche sont présentées dans le tableau supplémentaire 1.

La lignée cellulaire HT29-MTX a été utilisée pour évaluer la cytotoxicité des NP Ag à l'aide du test de méthyltétrazolium (MTT)39. HT29-MTX provient des cellules caliciformes du côlon mais sécrète la mucine MUC5AC, caractéristique des cellules caliciformes présentes dans les cellules du système respiratoire, plutôt que la mucine MUC2 caractéristique des cellules caliciformes du côlon. Les cellules HT29-MTX ont été cultivées dans des flacons T75 avec 10 % de CO2 à 37 °C dans 12 ml de milieu d'aigle modifié Dulbeco (DMEM, Sigma, Royaume-Uni) avec l'ajout de 10 % de FCS (Sigma, Royaume-Uni), 50 U/ml de pénicilline, 50 mg/ml de streptomycine (Sigma, Royaume-Uni), 50 mg/ml de gentamycine (Lonza, États-Unis) et 50 µg/ ml d'amphotéricine B (Lonza, USA).

Les cellules HT29 MTX ont ensuite été laissées au repos pendant 24 h dans du DMEM sans sérum contenant 50 U/ml de pénicilline, 50 mg/ml de streptomycine, 50 mg/ml de gentamycine et 50 µg/ml d'amphotéricine B. Des NP Ag ont ensuite été ajoutés à des concentrations de 7,5 à 0,225 µg/ml. Les cellules traitées à l'Ag NP et les cellules témoins ont été incubées pendant 24 h avec 5 % de CO2 à une humidité relative de 95 %. Le milieu a ensuite été retiré et les cellules lavées avec du PBS. Les puits ont ensuite été additionnés de 25 ml de solution de MTT (5 mg/ml) et ont été incubés pendant 4 h. Le milieu a été retiré et remplacé par 100 ml de DMSO et agité doucement pendant 15 min. Pour évaluer l'effet des NP Ag sur la viabilité cellulaire, le lecteur de plaque de dosage immuno-enzymatique a été utilisé pour mesurer l'absorbance à 570 nm et le pourcentage de cellules viables estimé pour les cellules traitées et témoins Ag NP.

L'université hachémite et le comité du service d'éthique de l'hôpital Prince Hamza ont accordé une approbation éthique pour cette étude de cas (numéro de référence 7/10/2019-2020). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. Les isolats cliniques PA des échantillons d'expectoration ont été prélevés après l'obtention du consentement éclairé de tous les patients atteints de mucoviscidose.

La moyenne (M) et l'erreur standard de la moyenne (SEM) d'au moins trois répétitions ont été utilisées pour exprimer les résultats expérimentaux. Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) a été utilisée pour identifier les différences entre les échantillons et les témoins. Les valeurs de DO des expériences de microplaque (avec et sans nanoparticules) à différentes dilutions ont été comparées à l'aide du test de Tukey. Les valeurs de P inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives. Les données ont été examinées à l'aide du logiciel Graphpad Instat 6.0.

Au cours de la préparation des Ag NPs, la formation d'Ag NPs provoque un changement de couleur dans le mélange réactionnel de l'orange au brun foncé, indiquant une réduction d'AgNO3 due à l'excitation de la résonance plasmonique de surface (SPR) dans les Ag NPs (Fig. 2 supplémentaire). Le spectre UV-Vis (illustré à la Fig. 1A) révèle un large pic d'absorption à environ 461 nm, ce qui est cohérent avec la résonance du plasmon de surface Ag qui se produit entre 450 et 500 nm.

(A – E) Le spectre UV – visible des NP Ag synthétisés (A). Les images STEM pour les NP Ag synthétisées, grossissement à 300 × (B) et à 200 nm (C). Les histogrammes de taille des Ag NPs (D), modèle XRD des Ag NPs synthétisés (E).

L'image STEM des NP Ag synthétisées à l'aide de l'extrait de graines de P. harmala est visible sur la Fig. 1. L'image en champ sombre de la Fig. 1B montre qu'il s'agissait de NP Ag biosynthétisés avec une taille moyenne de particules d'environ 11 nm. De plus, l'image en champ clair des NP Ag affichée sur la figure 1C met en évidence l'uniformité des particules synthétisées, leur forme sphérique et l'absence d'agrégation. Les histogrammes de taille des NP Ag sont présentés sur la Fig. 2D. Les histogrammes indiquent que la taille des particules principales des NP Ag fabriquées dans cette recherche est d'environ 10, 9 ± 2, 7 nm.

Les spectres FT-IR : (A) extrait de P. harmala. (B) NP Ag synthétisées.

Le modèle XRD de l'échantillon de nanoparticules d'argent préalablement amorcé a été documenté au Consortium UGC-DAE pour la recherche scientifique, Indore. A cet effet, un diffractomètre à rayons X Bruker d8 Advance a été utilisé. Les paramètres suivants ont été appliqués : source de rayonnement, CuKα, λ = 1,5406 Å ; 40 kV–40 mA ; mode balayage, 2θ/θ.

Une comparaison a été faite entre le diffractogramme, représenté sur la figure 1, et la carte de diffraction de puissance standard JCPDS, dossier argent n° 04-0783. Quatre pics ont été reconnus aux valeurs 2θ, c'est-à-dire 38,2901°, 44,5583°, 64,8185° et 77,4383°, qui ont été considérées comme reflétant l'argent métallique et les valeurs de plan d'argent associées de hkl, c'est-à-dire (111), (200), (200) et (311), respectivement. Sur la figure 1D.

La FT-IR a été utilisée pour identifier les interactions qui se produisent entre les atomes d'Ag et les produits chimiques bioactifs qui ont un impact sur la stabilité des NP d'Ag (Fig. 2). Des pics de spectres FT-IR similaires avec un léger décalage peuvent être observés dans les NP Ag biosynthétisés et les extraits de P. harmala. Sur les figures 2A, B, différentes couleurs de flèches représentent différents groupes fonctionnels. Le jaune indique le pic à 3533,98 cm-1 pour le spectre de l'extrait de P. harmala, qui est passé à 3318,33 cm-1 pour le spectre de l'extrait Ag NPs et a été attribué à l'étirement OH des groupes hydroxyle, y compris les alcools, les phénols et le groupe NH des amines ou des amides. Le rouge représente le pic à 1608,36 cm-1 pour le spectre de l'extrait de P. harmala qui est passé à 1629,49 cm-1 pour le spectre de l'extrait Ag NPs et a été attribué au groupe C = O des acides carboxyliques. Enfin, la flèche verte indique le pic du spectre de l'extrait de P. harmala à 725,87 cm-1 qui est passé à 888,70 cm-1 pour le spectre de l'extrait Ag NPs et a été attribué à C=CH2.

La sensibilité aux antibiotiques a été évaluée en utilisant l'approche de diffusion par disque. Quatre isolats cliniques (PA2, PA4, PA6 et PA5) ont démontré une résistance intermédiaire à un (Gentamicine), deux (Imipénème et Lévofloxacine), quatre (Imipénème, Gentamicine, Lévofloxacine et Ciprofloxacine) et cinq des antibiotiques utilisés dans cet essai (Méropénème, Gentamicine, Amikacine, Lévofloxacine et Ciprofloxacine) respectivement. Trois isolats cliniques (PA3, PA5 et PA6) se sont révélés résistants au céfépime. Cependant, il est important de noter qu'aucun des isolats n'était multirésistant (MDR). Le tableau supplémentaire 2 montre les résultats des tests de sensibilité aux antibiotiques pour l'ATCC et les souches cliniques, le PA5 ayant la résistance la plus élevée à tous les antibiotiques étudiés.

Après avoir incubé les échantillons à 37 ° C pendant 24 h dans des conditions aérobies et avec des NP Ag à des concentrations allant de 3, 9 à 1 000 μg / ml, une turbidité était présente dans les tubes à essai contenant 3, 9 à 7, 8 µg / ml de NP Ag. Cette turbidité indiquait que les bactéries se développaient à ces concentrations d'Ag NP. Cependant, aucune turbidité n'a pu être observée à des concentrations de 15,6 à 1 000 µg/ml, indiquant que la croissance bactérienne avait été inhibée. Des plaques de gélose BHI ont été inoculées avec les suspensions des tubes de 15,6 à 1000 µg/ml pendant une période de 24 h. Aucune bactérie n'a pu être observée à des concentrations de 31,25 à 1 000 µg/ml, ce qui confirme que les Ag NPs étaient bactéricides. Ainsi, à partir de ces résultats, il est évident que la CMI et la MBC des Ag NPs pour toutes les souches de PA étaient de 15,6 et 31,25 µg/ml, respectivement.

Les essais sur plaque de microtitration ont montré que toutes les souches étaient de puissants producteurs de biofilm (voir le tableau supplémentaire 3 pour plus de détails). Des NP Ag à des concentrations allant de 0,225 à 7,5 µg/ml ont été utilisées pour évaluer l'activité antibactérienne des NP Ag contre les souches PA (souche de référence et six souches cliniques) résistantes à divers antibiotiques. Malgré la variation entre les différentes souches, l'incubation des souches de PA avec des Ag NPs à des doses allant de 0,22 à 7,5 g/ml a eu un effet négatif sur la croissance (Fig. 3). À des concentrations de 0, 9 à 7, 5 µg / ml, les NP d'Ag se sont avérées générer une diminution significative de la croissance ( P <0, 05) dans quatre des souches de PA (ATCC, PA1, PA2, PA6). Les souches PA3, PA4 et PA5 ont été significativement impactées à des concentrations supérieures à 1,8 µg/ml (F (3,013, 11,08) = 61,93, P < 0,0001). Des concentrations inférieures à celle-ci ont affecté négativement la croissance de toutes les souches, bien que cela ne soit pas statistiquement significatif. Cependant, à 0,225 µg/ml, on observe une augmentation de la croissance de certaines souches de PA (ATCC, PA1, PA5 et PA6).

L'impact des Ag NPs sur la croissance planctonique des PA après 24 h d'incubation est indiqué par l'absorbance à 600 nm (axe y) pour la souche ATCC et six souches cliniquement isolées (PA1–PA6) à des concentrations d'Ag NPs de 0,22 à 7,5 µg/ml (axe x). ****< 0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

Le développement du biofilm de trois souches (ATCC, PA2, PA6) a été significativement impacté par les NP Ag à des concentrations égales ou supérieures à 0,45 µg/ml (F (1,931, 11,39) = 17,12, P = 0,0009). Seules les concentrations de 0,9 µg/ml et plus ont eu un impact substantiel sur PA1 et PA3. Des concentrations de 1,8 µg/ml ou plus réduisaient significativement la formation de biofilm des souches les plus résistantes de PA4 et PA5 (Fig. 4).

L'impact des Ag NPs sur le développement du biofilm pour la souche ATCC et six souches cliniquement isolées (PA1-PA6) après incubation pendant 24 h à des concentrations d'Ag NPs de 0,22 à 7,5 µg/ml (axe x). ****< 0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

L'analyse du métabolisme des PA dans les biofilms a révélé une baisse statistiquement significative des niveaux de PA par rapport au témoin (F (2,757, 16,94) = 43,30, P < 0,0001) (Fig. 5). Le métabolisme cellulaire du biofilm de TCC, ATCC, PA1, PA2 et PA6 a été significativement inhibé par 0,9 µg/ml Ag NPs. Des effets significatifs sur PA3 et PA4 ont été observés à des concentrations de 1,8 µg/ml et plus. La souche PA5 ne s'est avérée significativement impactée qu'à des concentrations supérieures à 3,75 µg/ml. Néanmoins, l'activité métabolique des cellules du biofilm de PA5 a été significativement affectée à toutes les concentrations d'Ag NP.

Impact des Ag NPs sur l'activité métabolique des cellules planctoniques PA, indiqué par l'absorbance à 600 nm (axe y) 4 h pour la souche ATCC et six souches cliniquement isolées (PA1-PA6) à des concentrations d'Ag NPs de 0,22 à 7,5 µg/ml (axe x). ****0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

Par rapport aux souches hospitalières, la souche de référence a démontré une plus grande sensibilité à toutes les concentrations d'Ag NP examinées. Les concentrations plus faibles d'Ag NPs nécessaires pour avoir un impact significatif sur la souche ATCC corroborent les résultats des dosages d'antibiotiques, où elle s'est avérée sensible à tous les antibiotiques testés.

L'effet des Ag NPs sur la production d'EPS a été examiné en cultivant les souches PA sans Ag NPs ou avec des concentrations sous-inhibitrices d'Ag NPs. Le poids sec de l'EPS extrait après culture était significativement plus faible dans les cellules traitées avec Ag NP que dans les cellules témoins (F (6, 42) = 8,38, P ≤ 0,0001). La figure 6 montre que le poids des EPS extraits de PA ATCC, PA1, PA3 et PA6 était significativement inférieur à celui du contrôle lorsqu'ils étaient cultivés en présence de concentrations d'Ag NP égales ou supérieures à 0,9 µg/ml. Pour PA2, PA4 et PA5, les réductions de la production d'EPS étaient statistiquement significatives à des concentrations d'Ag NP égales ou supérieures à 1,8 µg/ml.

Impact des Ag NPs sur la production d'EPS du biofilm, indiqué par le poids sec d'EPS (mg/100 ml) pour la souche ATCC et les six isolats cliniques (PA1-PA6) à des concentrations d'Ag NP de 0,22 à 7,5 µg/ml (axe x). ****0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

Les résultats indiquent que les NP Ag ont également réduit de manière significative la biomasse de PA colorée par CV dans les tests d'éradication qui évaluaient le traitement de biofilms préformés âgés d'un jour (F (20, 66) = 9, 148, P = 0, 0001). Dans le même temps, les NP Ag inhibaient l'activité métabolique des biofilms matures. La figure 7 montre que deux des souches (ATCC, PA6) ont montré des diminutions statistiquement significatives de la biomasse de coloration CV à des concentrations supérieures à 0,9 ug/ml. Trois souches (PA1, PA2, PA3) ont également été significativement inhibées par une concentration d'Ag NP de 1,8 µg/ml. La coloration CV substantielle de PA4 et PA5 a été significativement réduite par des concentrations supérieures à 3,75 ug/ml.

L'impact des Ag NPs sur l'éradication du biofilm mature après une incubation de 24 h à des concentrations de 0,22 à 7,5 µg/ml (axe x) indiqué par DO à 570 nm (axe y). (****0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01).

Le métabolisme de la communauté de biofilms préformés de souches PA incubées avec des Ag NPs a été significativement inhibé (F (6, 7) = 15,32, P = 0,001). Dans les souches PA2 et PA3, des concentrations d'Ag NP de 0,9 µg/ml ont significativement inhibé l'activité métabolique, mais des concentrations de 1,8 µg/ml ou plus étaient nécessaires pour inhiber de manière significative l'activité métabolique d'ATCC, PA1, PA5 et PA6. Seules des concentrations de 3,75 µg/ml et plus ont eu un impact significatif sur l'activité métabolique du PA4 (Fig. 8).

Impact des Ag NPs sur l'activité métabolique des cellules de biofilm matures en utilisant la coloration au TCC après 24 h d'incubation avec des concentrations d'Ag NPs de 0,22 à 7,5 µg/ml (axe x). Ceci est indiqué par DO à 570 nm (axe y) (< 0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01).

Les valeurs Ct calculées ont été utilisées pour déterminer les expressions correspondantes des gènes régulés par QS lasI, lasR, rhlI, rhlR, pqsR et pqsA. Les expressions des gènes ont d'abord été standardisées par rapport à la moyenne du gène de référence RopD. La figure 9 compare l'expression relative des gènes régulés par QS dans la souche PA exposée aux Ag NPs biosynthétisés (à des concentrations de 7,5 µg/ml et 0,45 µg/ml) aux échantillons témoins cultivés sans Ag NPs. Comme le montre la figure 7, les Ag NP réduisent l'expression des gènes régulateurs de QS. Par rapport au contrôle, où l'expression génique est supposée être de 100 %, toutes les souches PA sauf deux cultivées avec 7,5 µg/ml Ag NPs pendant 24 h montrent des expressions géniques régulées par QS significativement réduites. Les deux exceptions (LasR dans PA3 et LasI de PA4) ont montré des réductions d'expression mais cela était statistiquement non significatif.

L'effet des Ag NPs sur l'expression des gènes régulés par QS dans les souches PA exposées aux Ag NPs biosynthétisées par rapport à l'expression génique des témoins non exposés aux Ag NPs. Concentrations d'Ag NP de 7,5 µg/ml et 0,45 µg/ml. *< 0,01.

Le pourcentage d'inhibition variait entre les souches et entre les différents gènes (tableau 1). Par rapport à l'échantillon témoin, à 7,5 µg/ml Ag NPs, l'expression relative du système de gène Las a été nettement réduite dans toutes les souches. La diminution de LasR, LasB et LasI était comprise entre 25,7 et 63,3 %, 13,2 et 51,4 % et 15,7 et 69,4 %, respectivement. À des concentrations de 7,5 µg/ml, l'expression des gènes de rhIR et de rhII a montré des diminutions statistiquement significatives, allant de 19,7 à 43,8 % et de 16 à 40,3 %, respectivement. De plus, à la concentration élevée, l'expression de PqsA et PqsR était considérablement réduite par rapport aux témoins.

À la concentration de 0,45 µg/ml d'Ag NP, il y avait également des effets statistiquement significatifs sur l'expression relative de certains gènes. Les gènes du système Las étaient les plus touchés, avec une expression relative du gène LasR statistiquement réduite dans 4 souches (ATCC, PA1, PA2 et PA 6). L'expression du gène LasI a été significativement réduite dans ATCC et PA1, tandis que LasB n'a montré qu'une réduction significative dans PA1. Il n'y avait pas d'impact statistiquement significatif de la concentration de 0,45 µg/ml d'Ag NP sur le système RhI et pqs, mis à part sur l'expression du gène rhII dans PA3.

Les tests MTT ont été utilisés pour le dépistage initial de la cytotoxicité Ag NP sur les lignées cellulaires cancéreuses HT29-MTX. La lignée cellulaire HT29-MTX a montré une résistance élevée aux NP Ag à toutes les concentrations utilisées, sans réduction statistiquement significative de la viabilité cellulaire (F (6, 14) = 0,2871, P = 0,9334). Néanmoins, la viabilité cellulaire a été réduite de 4,1 % à une concentration d'Ag NP de 7,5 µg/ml à 0,2 % à 0,225 µg/ml (Fig. 10).

L'influence de différentes concentrations d'Ag NPs sur la viabilité de la lignée cellulaire humaine HT29-MTX après 24 h d'incubation. La viabilité cellulaire relative a été comparée au contrôle (testé/contrôle × 100). L'expérience a été réalisée 3 fois en double.

Les microbes formant un biofilm sont responsables de nombreuses maladies. Une étude réalisée par les National Institutes of Health et Center of Disease Control a révélé que les microbes formant un biofilm causaient entre 65 et 80 % des infections40. De nombreuses études ont indiqué que les NP servent d'inhibiteurs efficaces du biofilm contre les bactéries cibles41,42. De plus, dans des travaux antérieurs, nous avons constaté que les nanoparticules de ZnO jouaient un rôle essentiel dans la lutte contre le développement du biofilm dans le PA43 formant un biofilm. L'étude actuelle s'est concentrée sur l'utilisation de P. harmala dans la synthèse d'Ag NP car on pensait que cela avait des avantages à la fois biologiques et économiques. Les résultats mettent en évidence les importantes propriétés anti-QS, antibactériennes et antibiofilm des NP Ag biosynthétiques.

La réduction chimique est l'un des processus utilisés pour créer des Ag NPs44,45. Les approches de réduction sont considérées comme plus simples et plus abordables que d'autres méthodes alternatives46. De plus, il est fortement recommandé d'utiliser des techniques respectueuses de l'environnement pour synthétiser les NP Ag (c'est-à-dire des approches de synthèse verte impliquant à la fois des plantes et des micro-organismes)47. Dans la présente étude, des agents réducteurs de métabolites secondaires de plantes ont été utilisés pour créer les NPs48. Les NP Ag ont été biosynthétisées à l'aide de diverses plantes et divers processus biologiques ont été évalués. Dans le présent travail, P harmala a été utilisé, une herbe qui a de nombreux constituants phytochimiques qui ont été largement appliqués en médecine traditionnelle49.

Notre étude a révélé qu'au cours de la biosynthèse, les Ag NPs commencent à se développer lorsque le nitrate d'argent est exposé à l'extrait de graines de P haramla. Cela a été confirmé par des changements de couleur et l'utilisation de la spectroscopie UV-Vis. Les NP Ag biosynthétisées ont montré une forte bande d'absorption à 461 nm en raison de leurs caractéristiques SPR. La réduction et la stabilité des nanoparticules d'argent peuvent être causées par des interactions entre les atomes d'argent et les produits chimiques bioactifs50, et celles-ci ont été étudiées à l'aide d'une analyse FT-IR. Des pics similaires étaient évidents dans les spectres FT-IR de l'extrait de P. harmala utilisé pour synthétiser les Ag NPs, bien qu'il y ait également eu de petits décalages dans les deux spectres. Les spectres des NP Ag à base d'extrait de graines ont révélé une gamme de bandes d'absorption entre 1642 et 3351 cm-1. Cela indique que la biomolécule a la capacité de réduire et de stabiliser les ions argent (Ag+, Ag0) dans les NP Ag lorsqu'elle est placée dans un extrait aqueux de graines.

Une détection TEM supplémentaire a révélé que ces particules étaient de forme grossièrement sphérique et de taille uniforme, avec un diamètre moyen de 11 nm. Les propriétés antibactériennes des Ag NPs sont négativement corrélées à leur taille de particule, étant d'autant plus faibles que le diamètre est grand51. Selon Choi et al.52, les NP Ag inférieures à 15 nm peuvent pénétrer dans la bactérie et exercer des effets antibactériens nettement plus puissants que celles de 15 à 20 nm. Les particules de 1 à 15 nm sont capables d'adhérer à la surface de la bactérie.

Nous avons utilisé nos Ag NPs pour tester leur efficacité bactéricide contre les PA. Nos résultats ont démontré que les NP Ag avaient un puissant effet antibactérien sur le PA à de faibles concentrations, avec une CMI et un MBC entre 15,6 et 31,25 µg/ml, respectivement. La CMI des Ag NPs pour le PA a été rapportée comme étant de 0,59 à 50 µg/ml53,54,55,56,57,58,59,60. Le large éventail de valeurs de CMI trouvées dans différentes études est dû au fait que les différences dans les propriétés physicochimiques des nanoparticules (c'est-à-dire la forme, la taille et la présence de fragments de surface) ont un impact substantiel sur leur activité antibactérienne51. Le MIC de nos Ag NPs est cohérent avec la gamme inférieure des MIC connus, et cela est probablement dû à leur taille de particule relativement petite. Nous avons donc pu prévenir efficacement la croissance de PA en utilisant une faible concentration d'Ag NPs. L'effet inhibiteur des Ag NPs sur Escherichia coli (E. coli) et Staphylococcus aureus (S. aureus) a été étudié par Azizi et al.60, qui les a également synthétisés à l'aide de P. harmala. Alors que les Ag NPs produits étaient plus gros (23 nm), ils ont néanmoins montré une action inhibitrice modérée, démontrant à nouveau l'efficacité des Ag NPs contre les bactéries pathogènes. Cependant, les effets de l'Ag NP sur le PA n'ont pas été étudiés par ces auteurs.

Le test de la plaque de microtitrage a également été réalisé dans cette étude pour examiner l'inhibition de la formation de biofilm dans le PA en présence de différentes concentrations d'Ag NPs. Les résultats ont montré qu'il y avait en effet une inhibition statistiquement significative de la formation de biofilm (Figs. 3, 4) ainsi qu'une réduction de l'EPS (Fig. 6). Nos résultats sont conformes aux études antérieures menées par Haidari et al.61, qui ont étudié l'impact des NP Ag sur la production de biofilm dans diverses bactéries et ont découvert que les NP Ag à une concentration de 45 µg/ml peuvent inhiber la formation de biofilm de S. aureus de 89 % et d'E. coli de 75 %.

L'efficacité des NP Ag (taille 7–70 nm) contre la souche PA ATCC PAO1 a également été démontrée par Loo et al.62, qui ont montré que la dégradation de la matrice EPS entraînait une réduction de 95 % de la génération de biofilm par PA. Les NP Ag peuvent causer des dommages structurels importants aux biofilms bactériens. Cela peut être vu dans la morphologie modifiée des biofilms résultant de la lyse cellulaire14, des dommages à la paroi cellulaire et de la perturbation de l'ondulation de la membrane et de la polarisation/perméabilité de la membrane. Des souches particulières de bactéries forment également des matrices EPS spécifiques qui les enferment15. Les NP Ag interagissent électrostatiquement avec les membranes bactériennes, ce qui peut être suffisamment fort pour rompre les membranes et permettre aux NP de pénétrer dans le biofilm mature. Une étude menée par Haney et al.63, cependant, était contraire à nos conclusions et a constaté que le traitement des cellules avec des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques à une dose de 200 µg/ml augmentait la biomasse du biofilm PA. Cet effet s'explique par le fait que les cellules peuvent utiliser des nanoparticules de fer pour fournir du fer élémentaire, entraînant l'augmentation observée de la densité cellulaire et du développement de la biomasse du biofilm - un processus non disponible dans le cas des NP Ag.

Dans notre étude, les Ag NPs ont pu réduire la biomasse des biofilms établis. Cependant, des concentrations plus élevées sont nécessaires pour obtenir une réduction statistiquement significative que celle nécessaire pour avoir un impact significatif sur la formation précoce du biofilm, ce qui renforce l'idée que la fonction principale des biofilms est protectrice64,65. Selon Said et al.65, lorsque la matrice du biofilm est brisée par l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et le chlorure de benzéthonium (BC), les cellules du biofilm sont beaucoup plus sensibles aux NP Ag (mesurées par microcalorimétrie).

Nos résultats ont montré que les NP Ag réduisaient l'activité métabolique des PA dans le biofilm mature, ce qui est conforme aux mécanismes d'action mis en avant par Li et al.66 et Kim et al.67. Les NP Ag ont la capacité de pénétrer dans les cellules et de traverser leur peptidoglycane, leur périplasme et leurs membranes externes. C'est là qu'ils détruisent les déshydrogénases de la chaîne respiratoire et modifient le niveau d'oxygène dissous66,67. De plus, des interactions pourraient avoir lieu entre Ag+ et le groupe thiol (–SH) des cystéines pour générer –S–Ag. À son tour, cela inhiberait le développement et supprimerait l'activité enzymatique des cellules bactériennes66,68.

La pathogénicité bactérienne et la capacité de formation de biofilm sont contrôlées par le réseau QS69, qui contient des régulateurs transcriptionnels activés par leurs autoinducteurs naturels (c'est-à-dire, las et rhl22). En plus de réguler les traits de virulence, QS gère également la capacité de formation de biofilm PA. Des études menées par Solano et al.70 et Brindhadevi et al.69 ont montré que les PA avec lasR et lasI mutés créent des biofilms moins efficaces et peuvent être facilement éliminés par les antimicrobiens. Les exopolysaccharides et d'autres substances qui régulent la forme des communautés en croissance sont codés par des gènes activés par QS40.

Un certain nombre de systèmes jouent un rôle dans la co-régulation de la formation de biofilm dans le système PA global, y compris les systèmes las, rhl et pqs. Alors que LasI et RhlI régulent la synthèse des autoinducteurs, lasR et rhlR sont principalement impliqués dans le codage des activateurs transcriptionnels71. Les NP Ag peuvent interférer avec les voies las et rhl et empêcher la production de molécules de signalisation, empêchant la formation de biofilms dans PA en raison de l'impact anti-QS64,72. Dans le présent travail, lorsque les cellules bactériennes ont été traitées avec les NP Ag, l'expression de nombreux gènes importants des systèmes QS las, rhl et pqs (lasR, lasI, lasB, rhlI, rhlA, pqsR et pqsA) a été significativement diminuée par rapport au contrôle (Fig. 9 et Tableau 1).

Il a été suggéré que les NP Ag pourraient perturber le système QS primaire de PA. Néanmoins, il est important de noter que le développement de biofilms est un processus dynamique et que la production de QS suit un attachement bactérien irréversible ainsi que la multiplication et l'expansion des cellules post-inoculation. En conséquence, au cours des premières étapes du développement du biofilm, l'impact inhibiteur des Ag NP sur les biomasses du biofilm par interférence avec le système QS était distinct lors de la formation précoce du biofilm à des concentrations d'Ag NP inférieures à celles nécessaires pour affecter le biofilm établi.

Actuellement, on pense que les NP Ag agissent en perturbant l'intégrité et la membrane des parois cellulaires bactériennes, en augmentant la perméabilité de la membrane et en favorisant la mort cellulaire73. De plus, les NP Ag perturbent la réaction en chaîne respiratoire en se combinant avec des groupes sulfhydryle, ce qui provoque une peroxydation lipidique et facilite les dommages oxydatifs à l'ADN et aux protéines pertinentes, après quoi la mort cellulaire se produit74,75. Les NP Ag adhèrent également aux groupes d'ADN sulfureux et phosphoreux, ce qui peut finalement endommager l'ADN et interférer avec sa transcription et sa traduction76. De plus, les NP Ag interrompent la transduction du signal cellulaire et initient la mort cellulaire par la déphosphorylation des phosphotyrosines77. Lorsque les NP Ag sont exposées à des conditions aérobies, elles peuvent libérer Ag+ de la surface des particules. L'Ag+ libéré a un effet antimicrobien important car il interagit avec les parois cellulaires et les membranes des bactéries. C'est l'une des principales raisons de la toxicité des Ag NPs78.

Même si les NP Ag ont un grand potentiel pour servir d'agents antimicrobiens, leur innocuité chez l'homme et le développement d'une résistance à l'argent chez les bactéries, y compris les Pseudomonas, suscitent des inquiétudes. Le potentiel cytotoxique des NP Ag a entravé leur établissement en tant qu'agents chimiothérapeutiques prometteurs. Siddique et al.79 ont examiné le potentiel toxique des NP Ag contre les lignées cellulaires HeLa à diverses concentrations en utilisant le test d'absorption du rouge neutre. Leurs résultats ont révélé que ces NP étaient non toxiques jusqu'à des concentrations de 120 μg/ml et qu'un effet cytotoxique statistiquement significatif se produit à une concentration de 240 μg/ml, une concentration plus élevée que celle utilisée dans notre présent travail. De plus, la concentration toxique des NP Ag varie de 10 à 100 µg/ml dans des études qui ont évalué l'impact des NP Ag sur la culture cellulaire humaine in vitro80,81,82. Dans notre travail, aucune inhibition statistiquement significative n'a été trouvée lorsque nous avons défié la lignée cellulaire HT29-MTX avec les Ag NPs biosynthétisés à des concentrations similaires, ce qui suggère que les Ag NPs pourraient être sans danger s'ils sont utilisés en faibles quantités.

L'émergence de la résistance bactérienne à l'argent par le biais du transfert horizontal de gènes de bactéries83 est une grave préoccupation qui découle de l'utilisation croissante de l'argent en médecine et dans l'industrie, ainsi que dans les antimicrobiens domestiques. Certaines études ont montré que PA84 et d'autres espèces de bactéries85,86 étaient capables de réduire l'Ag+ soluble en Ag colloïdal ou NP Ag0, par un processus de réduction encore inconnu12. Muller et Merrett86 ont proposé que l'Ag+ soit éliminé par les bactéries du milieu environnant avant qu'il ne puisse pénétrer dans la cellule, réduisant ainsi le besoin de processus de liaison protéine-argent et d'efflux cellulaire. L'effet destructeur et inhibiteur de l'argent sur les biofilms n'empêche pas complètement les biofilms de s'adapter à l'argent sous les formes NAg et Ag+ ionique. Néanmoins, par rapport aux antibiotiques couramment utilisés, l'argent reste un agent antibiofilm efficace87,88.

Lors de l'examen de l'impact bactéricide des NP Ag, certaines souches de PA ont montré une augmentation inattendue de la croissance aux concentrations les plus faibles (Fig. 3). Dans des travaux antérieurs, des concentrations d'AgNO3 inférieures aux niveaux bactéricides (3 à 8 µg/l) se sont avérées stimuler, plutôt qu'inhiber, la croissance d'E. coli89. Des résultats similaires ont été obtenus par Schacht et al.90, où les NP d'Ag inférieures à 15 nm et à des concentrations comprises entre 20 et 60 µg/ml se sont avérées stimuler la croissance de certaines bactéries. Des NP d'Ag d'une taille de 2,8 à 10,5 nm et recouvertes de polyéthylène glycol ont été montrées par Xiu et al. 89 pour augmenter la croissance d'E. coli K12 de 6 à 13 % à des concentrations de 1,8 à 2,2 µg/ml. Les auteurs ont également trouvé des Ag NPs de 20 à 80 nm et recouverts de polyvinylpyrrolidone pour augmenter la croissance d'E. coli de 11 à 21 % à des concentrations de 5,7 à 16,4 µg/ml.

La croissance accrue ou stimulée d'organismes sous exposition sublétale à des agents inhibiteurs est une réponse à la dose biphasique connue sous le nom de réponse hormétique. Le modèle de réponse caractéristique des microbes est une croissance stimulée à de faibles concentrations de l'inhibiteur et une croissance inhibée à des concentrations élevées 91. Des études sur les effets des antibiotiques sur des bactéries qui ont connu des réponses hormétiques ont conclu qu'elles représentent un nouveau mécanisme de survie pouvant conduire à une croissance exponentielle en présence de faibles concentrations d'antibiotiques. Les réponses hormétiques ont également été étudiées en relation avec les NPs87,92, mais actuellement, la manière dont elles sont obtenues dans les cellules bactériennes est mal comprise. Les auteurs actuels ont tenté d'expliquer ces améliorations inattendues de la croissance en se référant à un processus non génétique connu sous le nom de « persistance ».

Ce mécanisme implique des sous-populations de cellules (cellules persistantes) qui sont moins affectées par les agents antibactériens et survivent donc plus longtemps que d'autres sous-populations plus sensibles 93. Dans les environnements à faibles concentrations d'Ag NPs (Ag+), le mécanisme de défense des cellules bactériennes a suffisamment de temps pour s'adapter aux effets toxiques des Ag NPs. La réponse « SOS » du réseau régulateur de réparation de l'ADN 94 est alors déclenchée par l'accumulation d'ADN simple brin aberrant à l'intérieur de la cellule causée par les effets génotoxiques de l'Ag NP.

Notre étude a révélé que les NP Ag peuvent réduire la croissance, prévenir la formation de biofilms et éliminer les biofilms PA établis. Ces résultats mettent en évidence l'avenir prometteur des NP Ag à utiliser comme agents antimicrobiens alternatifs ou en conjonction avec des antibiotiques. Le développement de la résistance à l'argent reste cependant préoccupant. Par conséquent, il est recommandé que la recherche se concentre sur l'examen de l'action combinée des NP Ag et des antibiotiques pour comprendre comment ils agissent contre différents micro-organismes, en particulier les souches hospitalières résistantes. Avec le temps, les NP Ag pourraient devenir une thérapie alternative efficace pour combattre les infections. Le contrôle stratégique et le traitement des infections par biofilm seront facilités à mesure que notre compréhension du mécanisme de formation du biofilm augmentera. La cascade de signalisation QS affecte une variété d'activités bactériennes, y compris la pathogénicité et la formation de biofilm95. En bloquant les cascades QS, la pathogénicité et la virulence bactériennes peuvent être diminuées. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour confirmer le mécanisme moléculaire des Ag NPs et QSI dans la prévention du développement du biofilm PA.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses fichiers d'informations supplémentaires.

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H Al-Momani a reçu un soutien financier du Département de la recherche scientifique de l'Université Hachémite/Jordanie (1331).

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Hafez Al-Momani & Ashraf I. Khasawneh

Faculté des sciences médicales appliquées, Université hachémite, Zarqa, 13133, Jordanie

Muna Almasri, Dua'A. Al Balawi, Lugain Ibrahim et Hadeel Albalawi

Département de technologie pharmaceutique et pharmaceutique, Faculté des sciences pharmaceutiques, Université hachémite, Zarqa, Jordanie

Juste Hamed

Nanotechnology Institute, Jordan University of Science & Technology, PO Box 3030, Irbid, 22110, Jordanie

Borhan Aldeen Albiss

Superviseur du laboratoire de microbiologie, département de médecine de laboratoire, Jordan University Hospital, Amman, Jordanie

Nour Aldabaibeh

Département des sciences médicales fondamentales, Faculté de médecine, Université appliquée Al-Balqa ', AL-Salt, Jordanie

Samir Al Haj Mahmoud

Département de pédiatrie, Faculté de médecine, Université hachémite, Zarqa, Jordanie

De Chine

Instituts de médecine cellulaire et de biosciences cellulaires et moléculaires, École de médecine de l'Université de Newcastle, Université de Newcastle, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, Royaume-Uni

Matthew Wilcox et Christopher Ward

Département de la production et de la protection des plantes, Faculté d'agriculture, Université de Jerash, Jerash, Jordanie

Muayyad Bani-Hani

Institut des biosciences, Faculté de médecine, Université de Newcastle, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, Royaume-Uni

Muneef Aldhafeeri, Matthew Wilcox et Jeffrey Pearson

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JAMBON. était responsable de la conception de l'étude, de l'analyse formelle, de l'investigation, supervisé DA, MA, LI et HAB pour la réalisation des expériences. JAMBON. figures et écritures préparées - brouillon original. DA, MA, LI et HAB : tous sont des assistants de recherche et sont responsables de la réalisation des expériences sous la supervision de HA-MNA et MK responsable de l'isolement et de l'identification des souches cliniques PA. BA, SH, MA et SA : responsable de la biosynthèse des nanoparticules d'argent et de la caractérisation des nanoparticules. BA a préparé la Fig. 1. MB : a entrepris l'identification formelle du Peganum harmala utilisé dans cette étude. AK, MW, JP et CW responsables de la conception de l'étude, ont co-écrit le manuscrit.

Correspondance à Hafez Al-Momani.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Al-Momani, H., Almasri, M., Al Balawi, D. et al. L'efficacité des nanoparticules d'argent biosynthétisées contre les isolats de Pseudomonas aeruginosa de patients atteints de mucoviscidose. Sci Rep 13, 8876 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35919-6

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Reçu : 23 février 2023

Accepté : 25 mai 2023

Publié: 01 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35919-6

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